近日，迪谱诊断与浙江大学医学院附属第一医院呼吸与重症医学科周华主任合作，将纳米孔测序技术应用于罕见真菌的全基因测序与进化分析研究成果, 在线发表于International Journal of Infectious Diseases《国际传染病学》杂志(IF：12.074)。研究成果表明，纳米孔单分子测序因其长读长、快速、实时测序的特点可作为未知、罕见等病原微生物快速鉴别及进化分析的重要工具，为临床精准诊疗提供巨大价值。
研究背景
免疫抑制剂的广泛使用使机会性真菌感染司空见惯。罕见真菌引起的侵袭性真菌病发病率越来越高，其中一些是由皮肤癣菌引起的。皮肤癣菌可侵入皮肤、头发和指甲等角化组织，并引起不同程度的宿主反应。多数情况下皮肤癣菌仅引起浅表皮肤感染，但一定情况下也可引起真菌血症、肺部疾病和播散性感染等。Arthroderma是皮肤癣菌中最多样化的属，最早于1963年被发现，并从兔洞或兔毛的土壤中分离出来。本研究发现了第一例由Arthroderma multifidum(简称A. multifidum)引起的慢性肺部真菌感染人类的病例，并对其基因组特征进行描述。
案例呈现
患者：63岁男性，反复咯血、咳嗽、咳痰4年。职业：动物皮毛加工厂工人，经常在无防护措施下处理动物皮毛。
病史：50年前，左上肺因肺结核受损；10年前，接受气胸手术。8年过敏性紫癜及类风湿性关节炎病史，2年免疫抑制剂服用史(泼尼松30mg/d)。
2019年6月，患者因咯血加重就医。胸部CT显示左肺上叶有慢性感染和受损病灶(见下图c/d)。IGRA、Xpert、涂片和培养均排除了结核感染。血、BALF的GM试验及细菌培养、mNGS(BALF)均为阴性。但BALF中培养出了一种未知的丝状真菌。基于纳米孔单分子测序平台，对其全基因组进行测序，序列经真菌数据库比对，证实该菌株为A. multifidum。将该菌株命名为浙江2016 A. multifidum。
治疗：2019年6月至12月，口服伏立康唑片200 mg，每天2次；每间隔2周，支气管镜下灌注两性霉素B(15 mg/次)共13次。
预后与随访：经过治疗，患者症状明显缓解。在治疗的最初6周内，BALF培养中检测到3次A. multifidum(2周/次)，此后10次BALF培养均为阴性。从2020年1月开始，为期2年零9个月的随访检查显示，患者未复发。
菌落特征
A. multifidum在35℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上(PDA)颜色最初为白色，一周后逐渐变为黄色。菌落呈粉状或颗粒状 ，扁平或放射状凹槽(见下图a)。分生孢子呈梨形，近球形或椭圆形，偶见1~2个隔膜。分生孢子大小约为3μm。
乳酸酚棉蓝染色后，可见圆形或梨形分生孢子与透明隔菌丝成直角附着(见下图b)。
全基因组测序和系统发育分析
基于纳米孔单分子测序平台对浙江2016 A. multifidum的全基因序列进行测定分析。结果显示，A. multifidum全基因组大小为23.22Mb(N50=2.50Mb)，由23个contigs组成(见下表)。全基因组中GC含量占比50.18%。BLAST比对分析显示，此序列与NCBI发表的A. multifidum的18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S基因的匹配度达到99.82%。
此外，本研究还进行了基因预测、初步功能注释和系统发育分析(见下图1)。结果显示，本研究已成功对6653个基因进行预测，对COG数据库中匹配的5287个基因进行功能分类，分属于25个类别。采用GO注释法对浙江2016 A. multifidum的预测基因进行同源序列分析。根据同源性程度，3314个基因被分为3个模块(生物过程、细胞成分和分子功能)。而与KEGG数据库的序列比对则显示了402条通路，涉及3732个基因，并对浙江2016 A. multifidum 株可能发生的潜在生物学途径进行概述。
图1 A. multifidum系统进化树
研究结论
本研究成功发现第一例由A. multifidum引起的人类肺部慢性感染病例，表明该真菌可引起人畜共患感染，且首次基于纳米孔单分子测序平台完成了该真菌的全基因组测序和系统进化分析。研究也充分证实，纳米孔测序技术因其长读长、PCR free的技术优势在未知/罕见真菌的检测方面，能最大限度保留原始序列的保真度，可作为未知/罕见病原体发现的有力工具。
机会性真菌感染的急剧增加也对快速、准确的临床诊断方法提出更高需求，迪谱诊断基于纳米孔单分子测序技术已开发迪谱纳®病原宏基因组测序、迪谱孔®病原多重靶向测序、迪谱孔®16S rDNA全长测序等多项本地化解决方案，快速、准确、高效的鉴别感染病原体的同时，也为临床精准选择药物提供参考依据。
