研究背景

结核病作为全球疾病十大死因之一，是重大公共卫生问题。其中耐药结核病(DR-TB)是结核控制面临的重大挑战。目前，DR-TB的实验室诊断主要依赖培养/药敏试验(DST)和核酸检测((NAAT)。然而，结核分枝杆菌(MTB)培养周期长，需要至少1-2个月才能获得结果。现有的分子诊断方法也仅针对利福平耐药位点进行检测。因此，临床迫切需要一种通量高、成本低、快速、便捷的检测技术，在鉴定结核分枝杆菌的同时可以获取多种耐药基因位点信息，以辅助诊断DR-TB。

DP-TOF核酸质谱是一款基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术原理，具有高灵敏度与高精度的多基因多位点检测平台。该产品整合了PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析的强大功能。本研究基于核酸质谱技术，开发了一种新的MTB鉴定及DR-TB检测的方法学，可以一次检测六大类药物的耐药位点信息。

本研究实验流程

研究内容

本研究纳入2021年6月至12月在西安胸科医院诊断为结核病的患者，共收集94例临床标本，包括52例支气管肺泡灌洗液样本(BALF)，42例痰液样本和128株MTB临床分离株。分别基于核酸质谱法、一代测序、定量PCR(qPCR)和MGIT960液体培养法，检测支气管肺泡灌洗液(BALF)和痰样本中的MTB，从不同维度分析比较各检测平台的性能指标，以研究核酸质谱在MTB检测中的价值。

研究结果

本研究基于不同平台进行多维度分析，证实核酸质谱在结核分枝杆菌鉴定和耐药基因检测中的价值。

培养阳性率为34.0%(32/94)，核酸质谱为51.1%(48/94)，qPCR为40.4%(38/94)。在94例确诊结核病患者中，培养阳性结核病患者的核酸质谱阳性率为96.9%(31/32)，培养阴性结核病患者的核酸质谱阳性率为27.4%(17/62)。两者都高于qPCR【87.5%(28/32)和16.1%(10/62)】。以培养法为标准，核酸质谱的总体灵敏度为96.9%，高于qPCR(87.5%)，各样本类型的灵敏度也高于qPCR。因此，核酸质谱比qPCR技术具有更高的诊断效率。

应用核酸质谱、高分辨熔解曲线(HRM)和Sanger测序，检测MTB临床分离株中的耐药基因突变。以Sanger测序为标准，分析核酸质谱法和HRM对MTB每个耐药位点的检测效能。同时，将核酸质谱法方法检测到的耐药基因突变与药敏试验(DST)结果进行比较，分析基因型与表型之间的关系。研究结果显示，核酸质谱对所有耐药基因突变的检测具有100%的灵敏度和特异性，与测序结果一致。而HRM检测耐药突变的敏感性和特异性分别为89.3%和96.9%，均低于核酸质谱方法。

将耐药基因突变质粒和野生型质粒以不同比例混合进行检测。核酸质谱结果显示，当突变比例为5-25％时，突变和野生型质粒可以同时检测到(图A)。将H37Rv和MDR-TB分离物以不同比例混合，核酸质谱结果显示，当混合物浓度为10⁵ CFU/mL时，突变型和野生型基因可以同时检测到(分别达到10⁴ CFU/mL)。当浓度低于10⁵ CFU/mL时，某些耐药基因的检测效率会降低(图B)。此外，突变型的质量强度与MDR-TB的浓度呈正相关，而质量强度的信号不受MDR-TB与H37Rv的比例干扰(图C)。

目前耐多药结核病(DR-TB)的实验室诊断主要依赖传统的DST和NAAT，研究表明，核酸质谱对MTB检测具有较低的检测限。DNA在核酸质谱仪上的扩增效率显著高于常规PCR技术。同时可以获得更多的MTB耐药基因信息。能够准确识别突变类型，获得更可靠的分子级耐药性结果，并为临床抗结核治疗提供参考。核酸质谱与金标准Sanger测序具有相同的准确性，核酸质谱技术是一种可以获取大量耐药基因准确突变位点信息并识别异质性感染的技术。它具有高灵敏度、操作和流程简单、高通量和低检测成本等特点。在临床DR-TB诊断中具有良好的应用前景，特别适用于专业的结核病医院。

迪谱诊断即将上线基于DP-TOF核酸质谱平台开发的MTB核酸质谱本地化解决方案，一次检测完成结核杆菌鉴定与六类药物9种耐药基因的检测。

快速、准确、高效、经济的验证结核分枝杆菌核酸阳性样本结果的同时，为临床选择敏感有效的抗结核药物提供参考依据。